کلونینگ ژن بیان کننده آنتی ژن سطحی ۱(sag۱) توکسوپلاسما گوندی و ترانسفورماسیون آن در دو سویه dh۵a و tg۱ اشرشیاکلی

زمینه و هدف: بیماری توکسوپلاسموزیس توسط تک یاخته انگلی به نام توکسوپلاسماگوندی(toxoplasma gondii) ایجاد می شود.sag1(surface antigen 1)، آنتی ژن اختصاصی ـ مرحله ای است که فقط در مرحله تاکی زوئیت وجود دارد و در مراحل اسپوروزئیت و برادی زوئیت وجود ندارد و به مقدار فراوان و به طور یکنواخت بر روی سطح داخل و خارج سلولی تاکی زوئیت ها توزیع شده است. این آنتی ژن دارای دو گلیکوفرم است و آنتی ژن، کاملاً conformational است. ژن کد کننده sag1، به صورت single copy بوده و هیچ اینترونی ندارد. sag1، ایمونوژنیک ترین ساختار تاکی زوئیت t.gondii است و به همین خاطر در چندین روش تشخیصی و برای تهیه واکسن نوترکیب و زیر واحدی علیه بیماری توکسوپلاسموزیس، استفاده شده و مورد توجه بوده است. هدف از این مطالعه، کلون کردن قطعه sag1 در پلاسمید ptz57r و ترانسفورم کردن پلاسمید نوترکیب در سویه های dh5α و tg1 باکتری های e.coli می باشد. روش بررسی: این تحقیق یک مطالعه تجربی می باشد. برای این کار، ابتدا انگل توکسوپلاسما در صفاق موش سوری تکثیر داده و آنگاه انگل با pbs(phosphate buffered saline) شستشو داده شد. جهت تهیه و نگهداری انگل، از موش سوری ماده استفاده شد. dna(deoxyribonucleic acid) ژنومی توکسوپلاسما، با روش فنل ـ کلر فرم، استخراج شده، سپس با کمک پرایمرهای اختصاصی ویژه ژن sag1، ژن مورد نظر با روش pcr(polymrase chain reaction) تکثیر شد و با استفاده از ژل آگاروز، محصول pcr، الکتروفورز شده و اندازه ژن تکثیر شده با استفاده از مارکر تعیین شد. محصول pcr با استفاده از کیت تجارتی، خالص شده و سپس به کمک آنزیم t4dna ligase، محصول pcr به داخل یک کلونینگ وکتور کلون شد. در نهایت پلاسمید نوترکیب به داخل سلولهای مستعد e.coli دو سوش tg1 و dh5α ترانسفورم شد. یافته ها: نمونه dna خالص سازی شده با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن sag1، pcr گردید. محصول pcr به صورت یک باند bp960(960 جفت باز) در ژل آگاروز 1% مشاهده گردید. محصول pcr درون پلاسمید ptz57r، کلون گردید، سپس پلاسمید نوترکیب درون باکتری اشرشیاکلی سوش های tg1، dh5α ترانسفورم گردید. برای شناسایی پلاسمید نوترکیب، ابتدا به کمک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک، کلونی های حاوی پلاسمید نوترکیب روی محیط lb جامد حاوی xgal(5- bromo-4 chloro-3 indolyl beta digalactopyranosid)، iptg(isopropyl-beta-dithio galactopyranosid) و آمپی سیلین جداسازی گردیدند، سپس پلاسمید نوترکیب استخراج شد و با روش pcr، ژن مورد نظر تایید گردید. پلاسمید نوترکیب حاوی ژن sag1 تحت تاثیر برش آنزیمی قرار گرفت که قطعات bp2982 و bp864 بدست آمده نیز نشانه تایید کار می باشد. کلونی های tg1 و dh5α که در محیط lb رشد کرده بودند، شمارش گردیدند و میانگین و انحراف معیار برای این دو سویه در هر پلیت براساس آزمون آماری mannwhitny مقایسه گردید. نتیجه گیری: نتایج نشان داد که پلاسمید ptz57r و استرین tg1 اشرشیاکلی بکار رفته در این تحقیق، برای نگهداری ژن sag1 مناسب می باشند.